Методические особенности спектрофотометрического определения белков в биологических жидкостях по реакции с бромпирогаллоловым красным

При проведении диагностических исследований результаты определения общего белка в биологических жидкостях зависят от аминокислотного состава присутствующих в них белков. В работе обсуждены некоторые аспекты спектрофотометрического определения белков в биологических жидкостях, в частности, особенности методики, основанной на реакции белков с бромпирогаллоловым красным (БПГК), важнейшим преимуществом которого является высокая и одинаковая чувствительность красителя к белкам альбуминовой и глобулиновой фракций. Это позволяет минимизировать погрешности, возникающие за счет несовпадения белкового состава анализируемых проб и используемых градуировочных растворов. Цель работы — исследование влияния условий и сроков хранения раствора БПГК на его аналитические свойства при спектрофотометрическом определении белков в биологических жидкостях. Стабильность оптических и аналитических свойств растворов реагента изучена с использованием критериев Фишера и Стьюдента при различных температурах хранения растворов, содержащих в качестве стабилизатора этанол или бензоат натрия. Проверку правильности определения общего белка по предложенной методике проводили методом «введено – найдено», вводя добавки стандартных растворов, приготовленных из калибраторов «Общий белок» или «Альбумин». Разработанная методика спектрофотометрического определения белков в моче по реакции с бромпирогаллоловым красным апробирована при анализе реальных объектов, метрологически аттестована и внесена в Федеральный реестр аттестованных методик выполнения измерений. Проведенные аналитические и метрологические исследования показали, что методика определения белков с использованием реагента на основе БПГК позволяет определять белки альбуминовой и глобулиновой фракций в биологических жидкостях человека с высокой и одинаковой чувствительностью. Для увеличения сроков хранения раствора реагента и сохранения его аналитических свойств рекомендуется использовать этанол в качестве стабилизатора.

общий белок, альбумин, глобулины, спектрофотометрический метод, бромпирогаллоловый красный, биологические жидкости

1. Schleicher E., Wieland O. H. Evaluation of the Bradford method for protein determination in body fluids / J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1978. Vol. 16. N 9. P. 533 – 534.

2. Marshall T., Williams K. M. Total protein determination in urine: elimination of a differential response between the coomassie blue and pyrogallol red protein dye-binding assays / Clin. Chem. 2000. Vol. 46. N 3. P. 392 – 398.

3. Samudra P. B., Swagata P., Shakuntala G., et al. Interference of sugars in the Coomassie Blue G dye binding assay of proteins / Anal. Biochem. 2009. Vol. 386. N 1. P. 113 – 115. DOI: 10.1016/j.ab.2008.12.006.

4. Trivedi V. D. On the role of lysine residues in the bromophenol blue — Albumin interaction / Ital. J. Biochem. 1997. Vol. 46. N 2. P. 67 – 73.

5. Vatassery G. T., Krezowski A. M., Sheridan M. A. Comparison of manual methods of determination of albumin in human cerebrospinal fluid by the bromcresol green and immuno-precipitation methods / Clin. Biochem. 1980. Vol. 13. N 2. P. 78 – 80. DOI: 10.1016/S0009-9120(80)91233-3.

6. Yalamati P., Bhongir A. V., Karra M., Beedu S. R. Comparative Analysis of Urinary Total Proteins by Bicinchoninic Acid and Pyrogallol Red Molybdate Methods / J. Clin. Diagn. Res. 2015. Vol. 9. N 8. P. 1 – 4. DOI: 10.7860/JCDR/2015/13543.6313.

7. Ларичева Е. С., Андреев Ю. Н., Козлов А. В. Способен ли метод определения белка в моче пирогаллоловым красным претендовать на роль основного / Лабораторная диагностика. 2009. № 1. С. 24 – 32.

8. Williams K. M., Marshall T. Protein concentration of cerebrospinal fluid by precipitation with Pyrogallol Red prior to sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis / J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. Vol. 47. N 3. P. 197 – 207. DOI: 10.1016/S0165-022X(00)00135-4.

9. Lynch K. M., Sellers T. S., Gossett K. A. Evaluation of an automted pyrogallol red-molybdate method for the measurement of urinary protein in rats / Eur. J. Clin. Chem. Clin Biochem. 1996. Vol. 34. N 7. P. 569 – 571.

10. Пупкова В. И., Прасолова Л. М. Метод с пирогаллоловым красным — альтернатива традиционным методам определения белка в моче / Клин. лаб. диагностика. 2007. № 6. С. 17 – 21.

11. Marshall T., Williams K. M. Interference in the Coomassie Brilliant Blue and Pyrogallol Red protein dye-binding assays is increased by the addition of sodium dodecyl sulfate to the dye reagents / Anal Biochem. 2004. Vol. 331. N 2. P. 255 – 259. DOI: 10.1016/j.ab.2004.04.029.

12. Da Silva A. S., Falkenberg M. Analytical interference of quinolone antibiotics and quinine derived drugs on urinary protein determined by reagent strips and the pyrogallol red-molybdate protein assay / Clin. Biochem. 2011. Vol. 44. N 12. P. 1000 – 1004. DOI: 10.1016/j.clinbiochem.2011.05.018.

13. Yanga Jui-Yi., Chiena Tzu-I., Lua Jin-Ying, Kaoa Jau-Tsuen. Heparin interference in the cerebrospinal fluid protein assay measured with a pyrogallol red-molybdate complex / Clin. Chim. Acta. 2009. Vol. 408. N 1 – 2. P. 75 – 78. DOI: 10.1016/j.cca.2009.07.011.

14. Fujita Y., Mori I., Kitano S. Color reaction between Pyrogallol Red — molybdenium(VI) complex and protein / J. Bunseki Kagaku. 1983. Vol. 32. P. 379 – 386. DOI: 10.2116/bunsekikagaku.32.12_E379.

15. Orsonneau J. L., Douet P., Massoubre C., et al. An improved pyrogallol red-molybdate method for the determining total urinary protein / Clin. Chem. 1989. Vol. 35. P. 2233 – 2235.

16. Watanabe N., Kamel S., Ohkubo A., et al. Urinary protein as measured with a pyrogallol-red-molybdate complex manually and in a Hitachi 726 automated analyzer / Clin. Chem. 1986. Vol. 32. P. 1551 – 1154. DOI: 10.1371/journal.pone.0100768.

17. Lefevre G., Bloch S., Le Bricon T., Billier S., et al. Influence of protein composition on total urinary protein determined by pyrocatechol-violet (UPRO Vitros) and pyrogallol red dye binding methods / J. Clin. Lab. Anal. 2001. Vol. 15. N 1. P. 40 – 42. DOI: 10.1002/1098-2825(2001)15:1<40::AID-JCLA8>3.0.CO;2-0.

18. Marshall T., Williams K. M. Protein determination in cerebrospinal fluid by protein dye-binding assay / Brit. J. Biomed. Sci. 2000. Vol. 57. N 4. P. 281 – 286.

19. Artiss J. D., Thibert R. J., Zak B. Spectrophotometric study of total protein-albumin methods applied to cerebrospinal fluid / 1981. Clin. Biochem. Vol. 14. N 1. P. 32 – 38. DOI: 10.1016/0009-9120(81)90165-X.

20. Миллер В. Г., Брунс Д. Е., Хортин Г. Л. и др. Современное состояние вопросов измерения и представления результатов выделения альбумина с мочой / Клин. лаб. диагностика. 2012. № 3. С. 43 – 53. DOI: 10.1373/clinchem.2008.106567.

21. Dube J., Girouard J., Leclerc P., Douville P. Problems with the estimation of urine protein by automated assays / Clin. Biochem. 2005. Vol. 38. P. 479 – 485. DOI: 10.1016/j.clinbiochem.2004.12.010.

22. Negin S., Wayne F. P., Mark J. L., Shepro D. Pyrogallol Red — molybdate: A reversible, metal chelate stain for detection of proteins immobilized on membrane supports / Electrophoresis. 1996. Vol. 17. P. 678 – 693. DOI: 10.1002/elps.1150170411.

23. Анисимович П. В., Починок Т. Б., Токарева Е. В. Спектрофотометрическое определение белков в биологических жидкостях / Журн. аналит. химии. 2017. Т. 72. № 12. С. 1069 – 1077. DOI: 10.7868/S0044450217120039.